本发明公开了一种从甘青铁线莲中提取、分离纯化得到的式（Ι）表示的三萜皂苷类化合物，该物质的苷元为3β,23-二羟基-齐墩果-18-烯酸。本发明化合物对缺氧/复氧模型诱导的心肌细胞损伤有明显的保护作用，可用于制备治疗缺血性心脏病药物，为研制新的缺血性心脏病治疗药物提供了先导化合物，可望为临床提供一种活性强、毒副作用小的心肌缺血/再灌注损伤治疗药物。
1.结构式（I）表示的三萜皂苷类化合物，xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="406"/>。
2.权利要求1所述三萜皂苷类化合物在制备治疗心肌缺血/再灌注损伤药物中的应用。技术领域
本发明涉及一种从铁线莲属植物中分离的新化合物，具体地说是从藏药甘青铁线莲中提取分离的一种三萜皂苷类化合物及其在治疗心肌缺血/再灌注损伤药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术
缺血性心脏病是人类最主要的致病死因，其高发病率和死亡率严重影响患者的生存质量，危及生命。目前临床治疗心血管疾病的药物主要有硝酸酯类，钙拮抗剂及β受体阻滞剂等。这些药物虽然具有一定的疗效，但频发的毒副作用限制了它们的应用。毛茛科铁线莲属植物甘青铁线莲(Clematisxa0tangutica)，别名唐古特铁线莲，藏药名又称叶芒那布、叶濛。主要分布于青藏高原地区，根据《晶珠本草》和《藏药志》等典籍记载，其性辛、甘、温，祛寒，增生胃火，活血通瘀，破痞瘤积聚。此外，甘青铁线莲作为复方制剂益心康泰胶囊的主药在治疗心脑血管疾病方面疗效显著。已有文献报道了甘青铁线莲中的三萜皂苷类成分（Zhongxa0HM,xa0Chenxa0CX.xa0etxa0al,xa0Triterpenoidxa0Saponinsxa0fromxa0Clematisxa0tangutica.xa0Plantaxa0Med,xa02001,xa067xa0(5),xa0484；Duxa0ZZ,xa0Zhuxa0N.etxa0al,xa0Twoxa0newxa0antifungalxa0saponinsxa0fromxa0thexa0Tibetanxa0herbalxa0medicinexa0Clematisxa0tangutica.xa0Plantaxa0Med.2003,69:547-551），但甘青铁线莲的有效成分仍不明确。
发明内容
本发明目的是提供一种对缺血/再灌注损伤心肌细胞有明显保护作用的三萜皂苷类化合物；本发明另一目的是提供上述三萜皂苷类化合物的提取方法和应用。本发明实现过程如下：一种从甘青铁线莲中提取分离的新的三萜皂苷类化合物，采用高分辨质谱和二维核磁共振谱等光谱技术，以及化学方法，确定了该化合物的化学结构，结构式（I）表示的三萜皂苷类化合物，xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="437"/>其化学名称为3β-O-[3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-23-羟基-齐墩果18烯-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖(3β-O-[3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl]-23-hydroxyolean-18-en-28-oicxa0acid-28-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside)，是从甘青铁线莲中分离的新的三萜皂苷类化合物，以下简称其为RAEG。所述式（ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="8"/>）化合物RAEG的制备方法，具体步骤如下：（1）提取：甘青铁线莲为原料，原料经粉碎后，按重量体积比加入3~5倍原料重的甲醇或乙醇回流提取，共提取3次，每次1~3小时。合并提取液，回收溶剂，得甲醇或乙醇提取物，提取物分散于按重量体积比4~8倍的水中，再依次用石油醚、水饱和正丁醇萃取3次，回收溶剂，分别得到石油醚和正丁醇的两个萃取部位。（2）分离：上述正丁醇层采用硅胶柱层析，以体积比为8:2:1～6.5:3.5:1的氯仿-甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，薄层层析检测，收集含式ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="8"/>化合物RAEG的流份，再用Sephadexxa0LH-20凝胶柱层析，以甲醇为流动相洗脱除去多糖和其他杂质，合并含RAEG的流份。最后再经高效液相色谱仪分离纯化，体积比为72:28的甲醇-水混合溶剂为流动相洗脱，得到RAEG的纯品。本发明从甘青铁线莲中提取、分离纯化得到式（I）化合物RAEG，式（I）化合物RAEG的苷元为3β,xa023-二羟基-齐墩果-18-烯酸，在铁线莲属植物中首次发现。该三萜皂苷类化合物RAEG在50xa0μmol/L~100xa0μmol/L的浓度能降低细胞上清中肌酸激酶和乳酸脱氢酶的水平，从而抑制缺氧/复氧模型诱导的心肌细胞损伤，并且存在一定的剂量依赖性。本发明化合物对缺氧/复氧模型诱导的心肌细胞损伤有明显的保护作用，可用于制备治疗缺血性心脏病药物，为研制新的缺血性心脏病治疗药物提供了先导化合物，可望为临床提供一种活性强、毒副作用小的心肌缺血/再灌注损伤治疗药物。
具体实施方式
下面结合具体实施例来说明本发明的实质。应理解，这些实施例仅用于证实本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：采集青海省黄南自治州的甘青铁线莲全草作为原料，原料经粉碎成粗粉后，取3公斤，加入15升浓度为70%的乙醇进行回流提取，共提取3次，每次3小时。合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物540克。提取物分散于4.5升水中，用石油醚萃取3次，每次4.5升。萃取后的水相再用正丁醇萃取3次，每次4.5升，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂后得到总皂苷提取物120克。将总皂苷进行硅胶柱层析，以体积比为8:2:1～6.5:3.5:1(均取下层作为洗脱液)的氯仿-甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，按150xa0mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检测（薄层展开溶剂为氯仿-甲醇-水(6.5:3.5:1)的下层，显色剂为体积比为1:4的硫酸-甲醇溶液，喷显色剂后于105xa0°C加热显色），收集含RAEG的第28～37流份，减压蒸干溶剂后得4.2克样品。样品采用Sephdexxa0LH-20xa0(GE-Healthcare公司)葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇为流动相洗脱除去多糖和其他杂质，按20xa0mLxa0为一个流份接收，薄层层析检测，合并含RAEG的第9～14流份，减压蒸干溶剂后得0.9克样品。最后经高效液相色谱仪(戴安公司)分离纯化(HPLC条件为：YMC-Packxa0R&Dxa0ODS-A色谱柱20xa0′xa0250xa0mm，72%甲醇为流动相，流速8xa0mL/min，25xa0°C，206xa0nm紫外检测)，得到RAEG的纯品32.6毫克。实施例2采集青海省黄南自治州的甘青铁线莲全草作为原料，原料经粉碎成粗粉后，取3公斤，加入12升浓度为70%的乙醇进行回流提取，共提取3次，每次2小时。合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物510克。提取物分散于3升水中，用石油醚萃取3次，每次3升。萃取后的水相再用正丁醇萃取3次，每次3升，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂后得到总皂苷提取物115克。将总皂苷进行硅胶柱层析，以体积比为8:2:1～6.5:3.5:1(均取下层作为洗脱液)的氯仿-甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，按150xa0mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检测(薄层展开溶剂为氯仿-甲醇-水(6.5:3.5:1)的下层，显色剂为体积比为1:4的硫酸-甲醇溶液，喷显色剂后于105xa0°C加热显色)，收集含RAEG的第28～36流份，减压蒸干溶剂后得3.8克样品。样品采用Sephdexxa0LH-20xa0(GE-Healthcare公司)葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇为流动相洗脱除去多糖和其他杂质，按20xa0mLxa0为一个流份接收，薄层层析检测，合并含RAEG的第8～12流份，减压蒸干溶剂后得0.8克样品。最后经高效液相色谱仪(戴安公司)分离纯化(HPLC条件为：YMC-Packxa0R&Dxa0ODS-A色谱柱20xa0′xa0250xa0mm，72%甲醇为流动相，流速8xa0mL/min，25xa0°C，206xa0nm紫外检测)，得到RAEG的纯品30.4毫克。实施例3：采集青海省黄南自治州的甘青铁线莲全草作为原料，原料经粉碎成粗粉后，取1公斤，加入3升甲醇进行回流提取，共提取3次，每次1小时。合并提取液，减压回收溶剂，得甲醇提取物150克。提取物分散于0.6升水中，用石油醚萃取3次，每次0.6升。萃取后的水相再用正丁醇萃取3次，每次0.6升，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂后得到总皂苷提取物45克。将总皂苷进行硅胶柱层析，以体积比为8:2:1～6.5:3.5:1(均取下层作为洗脱液)的氯仿-甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，按150xa0mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检测(薄层展开溶剂为氯仿-甲醇-水(6.5:3.5:1)的下层，显色剂为体积比为1:4的硫酸-甲醇溶液，喷显色剂后于105xa0°C加热显色)，收集含RAEG的第26～35流份，减压蒸干溶剂后得1.4克样品。样品采用Sephdexxa0LH-20xa0(GE-Healthcare公司)葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇为流动相洗脱除去多糖和其他杂质，按18xa0mLxa0为一个流份接收，薄层层析检测，合并含RAEG的第8～13流份，减压蒸干溶剂后得克样品0.3克。最后经高效液相色谱仪(戴安公司)分离纯化(HPLC条件为：YMC-Packxa0R&Dxa0ODS-A色谱柱20xa0′xa0250xa0mm，73%甲醇为流动相，流速8xa0mL/min，25xa0°C，206xa0nm紫外检测)，得到RAEG的纯品12.1毫克。化合物的结构鉴定化合物RAEG为白色不定形粉末，ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="79"/>(cxa00.13,xa0MeOH)，Liebermann-Burchard反应和Molish反应均为阳性。ESI-MS给出准分子离子峰m/zxa01243xa0[M+Na]⁺xa0(正离子模式)和m/zxa01219xa0[M?H]^－(负离子模式)；HR-ESI-MS(正离子模式)给出准分子离子峰xa0m/zxa01243.6097xa0[M+Na]⁺xa0(计算值C₅₉H₉₆NaO₂₆,xa01243.6088)，结合¹Hxa0NMR和¹³Cxa0NMR波谱数据（表1），确定其分子式为C₅₉H₉₆O₂₆。¹Hxa0NMR的高场区给出六个特征的角甲基单峰信号δ_Hxa00.79,xa00.87,xa00.94,xa01.01,xa01.01,xa01.12xa0(均为s，3H)，一个烯氢信号δ_Hxa05.19xa0brxa0s和一组羟甲基信号d_Hxa03.69，4.09；结合¹³Cxa0NMR中给出的两个烯碳信号δ_Cxa0132.9，137.8可判断化合物RAEG的苷元为3β,xa023-二羟基-齐墩果-18-烯酸。C-3位信号δ_Cxa081.0和C-28位信号δ_Cxa0175.4表明该化合物为3和28位均连糖的双糖苷。通过分析NOESY谱可知H-3xa0δ_Hxa04.21分别与H-5和H-23a有相关，可判断3位寡糖基的相对构型为β构型。ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="498"/>ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="490"/>ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="504"/>对化合物RAEG采用三氟乙酸进行水解并常法制备水解产物（糖部分）的三甲基硅醚化衍生物，以L-Chirasil-Val气相色谱柱(25xa0mxa0×0.32xa0mm.)进行GC分析，经与标准糖制备的相应衍生物作对照。结果显示化合物RAEG中存在L-阿拉伯糖、L-鼠李糖和D-葡萄糖，组成比例为1:2:2。¹Hxa0NMR给出五个糖的端基氢信号分别为δ_Hxa06.32xa0(d,xa0Jxa0=xa08.1Hz,xa0Glcxa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="8"/>xa0H-1),xa04.91xa0(d,xa0Jxa0=xa07.6xa0Hz,xa0Glcxa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="13"/>xa0H-1),5.82xa0(brs,xa0Rhaxa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="8"/>xa0H-1),xa05.09xa0(d,xa0Jxa0=xa06.1xa0Hz,xa0Araxa0H-1)xa0andxa06.21xa0(brs,xa0Rhaxa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="13"/>xa0H-1)，通过HSQC谱进一步确认了糖的端基碳信号95.8,xa0104.9,xa0102.7,xa0104.3和101.6。结合¹H-¹Hxa0COSY,xa0TOCSY,xa0HSQC,xa0NOESYxa0及xa0HMBC谱对归属了所有糖单元上的碳、氢信号。HMBC谱中显示Araxa0H-1/C-3,xa0Rhaxa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="13"/>xa0H-1/AraC-2,xa0Glcxa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="8"/>xa0H-1/C-28,Glcxa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="13"/>xa0H-1/Glcxa0C-6及Rhaxa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="8"/>xa0H-1/Glcntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="13"/>xa0C-4存在远程相关确认了糖与苷元的连接位点及糖链的连接顺序。这一结论在NOESY谱中得到了证实。综上所述，化合物RAEG的结构鉴定为3β-O-[3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-23-羟基-齐墩果18烯-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖。化合物对缺血/再灌注损伤的心肌细胞的保护作用研究对实施例1提取分离的式（I）化合物RAEG对缺血/再灌注损伤的心肌细胞的保护作用进行了检测，试验所采用的细胞为新生大鼠心肌细胞，其分离和培养方法依据文献(Akaoxa0M,xa0Ohlerxa0A,xa0etxa0al.xa0Mitochondrialxa0ATP-sensitivexa0potassiumxa0channelsxa0inhibitxa0apoptosisxa0inducedxa0byxa0oxidativexa0stressxa0inxa0cardiacxa0cells.xa0Circxa0Res,2001,88(12):1267-1275)方法进行，并通过以下试验检测该化合物的心肌保护活性。(1)xa0MTT法测定细胞存活率`根据细胞生长速率，将处于对数生长期的细胞以1xa0×xa010<sup>4</sup>个细胞/孔接种于96孔培养板，贴壁生长48小时后，弃去原培养液，加入用DMEM培养液配制好的含不同浓度(50xa0μmol/L~100xa0μmol/L)本发明化合物的溶液200xa0μL，每个浓度设6个复孔，并设对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液）、无细胞调零孔和盐酸地尔琉卓阳性对照孔，置37°C培养箱(5%xa0CO<sub>2</sub>)中培养24小时。随后细胞置于缺氧小室(95%xa0N<sub>2</sub>xa0+xa05%xa0CO<sub>2</sub>,xa037xa0°C)中培养3小时，复氧培养(95%xa0O<sub>2</sub>xa0+xa05%xa0CO<sub>2</sub>,xa037xa0°C)1小时。加入PBS溶解的终浓度为5xa0mg/mL的MTTxa0(Sigma公司)xa020xa0μL，在正常条件下孵育4小时。最后，每孔加入150xa0μL的二甲基亚砜，混匀。将96孔板置酶标仪上测定各孔在490xa0nm处的吸光度(OD)值。按下式计算被测物对细胞存活率：细胞存活率＝治疗组OD值/对照组OD值×100%`假设对照组的细胞存活率为1。统计学分析：所有数据均采用SPSS13.0统计学软件进行分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.01，P<xa00.05认为有统计学差异，实验结果见表2。ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="499"/>与模型组比，50μmol/L，75μmol/L，100μmol/L组均能提高缺氧/复氧损伤后心肌细胞的存活率，有一定的剂量依赖性。表明化合物RAEG对缺氧缺血后的细胞有保护作用。(2)xa0乳酸脱氢酶和肌酸激酶含量测定法根据细胞生长速率，将处于对数生长期的细胞以5xa0×xa010⁵个细胞/孔接种于24孔培养板，贴壁生长48小时后，弃去原培养液，加入用无血清DMEM培养液配制的含不同浓度(50xa0μmol/L~100xa0μmol/L)本发明化合物的溶液200xa0μL，每个浓度设3个复孔，并设盐酸地尔琉卓阳性对照、正常培养对照组，细胞在37xa0°C、5%xa0CO₂条件下培养24小时后，置于缺氧小室(5%xa0CO₂+95%xa0N₂,xa037xa0°C)中培养3小时，再复氧培养(5%xa0CO₂+95%xa0O₂,xa037xa0°C)1小时。细胞损伤指标乳酸脱氢酶和肌酸激酶含量采用试剂盒（南京建成生物工程有限公司）测定，具体实验方法依据生产商提供的方法进行，分别于660xa0nmxa0和xa0340xa0nm处采用酶标仪测定乳酸脱氢酶和肌酸激酶的含量。统计学分析：所有数据均采用SPSS13.0统计学软件进行分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P<xa00.05认为有统计学差异，实验结果见表3。ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="571"/>结果显示，与模型组比，化合物RAEGxa050μmol/L，75μmol/L，100μmol/L组均能显著降低细胞上清液中乳酸脱氢酶和肌酸激酶的含量，且呈一定的剂量依赖性。提示RAEG对大鼠心肌细胞缺氧缺血性损伤有治疗作用，可用于制备治疗心肌缺血/再灌注损伤的药物。